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- Posté le: Mer 17 Juil 2002 14:52
Note préliminaire : ce texte a été traduit par bibi d'après <A href="http://www.une.edu.au/agronomy/hort/ptc_for_home_~1.htm">ce site</A> les NDT sont les notes de Thrand... Je n'ai pas testé la méthode, donc on ne me crie pas dessus si ça ne marche pas !
A quoi ça sert ? (par Thrand/organja.com)
Avantages
-on peut partir d'une très petite quantité de matériel végétal et produire avec de très nombreuses boutures
-les microboutures ont tendances à "brancher" plus que les plantes normales, et donc à être très touffues
-les boutures issues de ces microboutures prennent plus facilement
-on doit pouvoir se servir de cette technique pour bouturer des plants en floraison
-une microbouture se transporte très facilement
Inconvénients
-c'est un boulot monstre...
-les microboutures sont très fragiles au début de leur vie
Propagation (organja.com)
Cette procédure explique en détail comment reproduire des plants de cannabis en nombres incroyables avec la technique de culture de tissus. De petites variations dans les nutriments et le milieu de transplantation sont permises et devraient être tentées, puisque c'est une science relativement nouvelle pour les cultivateurs de cannabis.
Liste de matériel
-cocotte minute pour stériliser tout le matériel
-aquarium (40L) à utiliser comme cabinet de culture
-20 petits récipients avec couvercle et joint (250 à 500 mL) (NDT : pots à bébés ou à conserves par ex., mais on peut utiliser des tubes à essais bouchonnés avec du coton)
-petit brûleur à propane ou autre flamme "propre" (NDT : gazinière !)
-rasoir et pinces fines
-vaporisateur à plantes rempli d'alcool isopropylique (isopropanol) (NDT : l'alcool à désinfecter classique est très bien)
-plusieurs feuilles de papier blanc ou de papier absorbant
-tasse remplie d'eau de javel et d'eau distillée (rapport de 1 pour 4)
-savon anti-bactérien
-mélange nutritif (recette ci-dessous)
Recette
Mélanger dans une casserole à sauce (NDT : fond épais et intérieur téflonné) :
1,4 L d'eau distillée dans lequel sont dissous 7 mL d'engrais NPK 10-10-10
1/4 de tasse (60 mL) de sucre blanc de table
60 mL de flocons d'agar (NDT : on peut trouver de l'agar dans les épiceries exotiques comme Tang Frères)
250 mg d'inositol (en poudre ou en tablettes)
1/2 tablette multivitaminée (qui doit contenir de la thiamine ie. vitamine B1 )
Amener le mélange à légère ébullition, jusqu'à dissolution de l'agar. Ne pas laisser le mélange adhérer et brûler (l'agar tend à faire cela). En utilisant une petite louche, verser le mélange dans la moitié des récipients jusqu'à une hauteur de 2 cm. Placer les couvercles et joints fermement sur les récipients et cuire à la cocotte pendant 15 minutes (NDT 30 minutes c'est mieux) après début du sifflement. Enlever et laisser refroidir jusqu'à température ambiente (NDT ie. au moins 3-4h).
Le rasoir et les pinces fines doivent maintenant être stérilisées. Les enrouler dans du papier aluminium et leur faire subir la même cuisson. Après ça, placer le papier blanc dans un livre de poche (NDT : hérésie !!!) et le placer dans la cocotte AU-DESSUS de la surface de l'eau. Stériliser comme avant et placer le sac humide dans un four à 65°C jusqu'à ce qu'il sèche. Ne pas ouvrir le sac jusqu'à utilisation des feuilles de papier. Il faudra aussi 500 mL d'eau stérilisée, qu'on peut acheter en pharmacie ou faire bouillir soi-même (NDT : 10 min au moins).
Une fois que tout est stérilisé, des microboutures vont être prélevées. Couper plusieurs morceaux de 2,5 cm de cannabis à partir des bourgeons et des tiges en croissance. S'assurer que des feuilles y sont attachées. Plonger les boutures dans le mélange de javel et agiter de temps à autre pendant 15 minutes. Récupérer les morceaux de plante et les rincer plusieurs fois à l'eau stérilisée. Maintenant on a des explants stériles.
Faire ceci pour assurer la stérilité : attacher ses cheveux, retrousser ses manches et laver ses mains au savon antibactérien. De plus, vaporiser l'intérieur de l'aquarium avec le spray d'alcool. Mettre l'aquarium sur le côté jusqu'à ce que l'alcool soit totalement évaporé avant de continuer.
Cette étape doit être faite dans l'aquarium pour maintenir la stérilité. Prendre un explant stérilisé du pot d'eau stérilisé avec les pinces fines et placer chacun dans un pot rempli de nutriment séparé. Cela empêche les contaminations de se propager. Refermer les pots hermétiquement et les placer dans un endroit sombre à température ambiente. Les laisser 1 mois (NDT : eh oui...).
Entre le moment où vous les entreposez et le moment où vous les récupérez, plein de choses peuvent arriver : la solution de javel pourrait les avoir tués, ou ils pourraient avoir été détruits par des pathogènes à cause d'une mauvaise stérilisation, ou les pousses pourront avoir proliférées depuis les aisselles (NDT pô sûr de la traduction là...) des tiges. Jetez les morts et préparez le milieu d'enracinement.
NDT : à ce stade on obtient normalement si j'ai bien suivi une masse de cellules indifférenciées nommé cal.
Multiplication et milieu d'enracinement
Mélanger dans une casserole à sauce :
le même mélange de nutriments plus 120 mL de lait de coco et 2,5 mL (1/2 cuillère à café) de malt OU 120 mL de purée de tomates vertes fraîche OU 120 mL de jus d'orange frais (chaque mélange donnera des résultats différents).
Avec une bandelette pH, vérifier que le pH est entre 5 et 6 (NDT par pitié, ne faites pas subir ça à votre pHmètre). Si cela sort de ces limites, utiliser de l'acide citrique (jus de citron) pour abaisser ou du bicarbonate de sodium (NDT disponible au rayon gâteaux du supermarché probablement) pour relever le pH. Bouillir le tout comme précédemment, remplacer les bocaux vides et les stériliser à la cocotte. Laisser refroidir complètement avant de continuer.
Stériliser les pinces fines, le rasoir et le papier absorbant comme précédemment et se laver les mains vigoureusement au savon antibactérien. Dans l'aquarium, ouvrir les pots (un à un) et avec les pinces, enlever la pousse et la placer sur du papier absorbant stérile humide. Plonger le rasoir dans l'eau stérilisée et séparer les nouvelles pousses. Prendre ces pousses et les placer dans des pots contenant le mélange de multiplication. A ce stade on peut placer jusqu'à 4 pièces par pot. Couvrir les pots et les replacer comme précédemment. Vous pouvez répéter cette étape autant de fois que vous voulez pour obtenir le nombre de boutures que vous voulez. Chaque pousse quadruple en 30 jours.
Une fois que vous avez le nombre désiré de pousses, laissez les grandir jusqu'à une taille de 2,5 cm. Quand les pousses ont des racines vous êtes presque tiré d'affaire.
Comment acclimater les plantelettes ?
Remplir autant de pots que désiré avec un milieu de croissance ferme (terreau, vermiculite) et arroser abondamment. Quand les pots ont relargué l'excès d'eau, enlever les plants de leurs bocaux avec les pinces et rincer le mélange de nutriment avec de l'eau tiède. Utiliser un stylo pour faire un petit trou dans le milieu de croissance, et mettre les racines dedans, en recouvrant doucement avec le milieu. Vaporiser la plante avec de l'eau et la placer dans une bouturette, à l'abri de la lumière directe. Les ramener graduellement dans des conditions normales et surveiller attentivement tout signe de stress. Après un mois, on peut traiter les plantes comme le donneur initial. Durée totale du prélèvement à la plantelette : 60 jours. Comme tous les plants sont les mêmes, ils seront identiques en taille, vitesse de croissance et puissance. C'est peut-être laborieux, mais la culture de tissu paye vraiment à long terme.
Si vous avez de fréquents problèmes de contamination, vérifiez vos procédures de stérilisation. Vous pouvez aussi ajouter du nitrate d'argent au mélange initial, dans un but d'antiseptie. Si une cuillère à café de AgNO3 (concentration : 100 mg/L) est ajouté au mélange de nutriments, il restera sans bactéries pendant 20 jours. De plus, il a été montré que le nitrate d'argent augmente le succès des régénérations in-vitro grâce à ses propriétés anti-éthyléniques.
NDT : l'éthylène est l'une des 5 principales hormones végétales (avec l'auxine, la cytokinine, la gibbéréline et l'acide abscissique), et il est responsable entre autres de la maturation des fruits, de l'inhibition de la croissance, de la chute des feuilles et du vieillissement. Il est donc a priori présent pendant la phase de floraison et le nitrate d'argent devrait favoriser la reprise des explants prélevés sur des plants en floraison.
On doit pouvoir améliorer ce protocole en utilisant de l'auxine et de la cytokinine. Amusez-vous...
Où se procurer du matériel pour le microbouturage (par Thrand) ?
Quelques boutiques de VPC notamment commercialisent des kits d'introduction à la culture in-vitro pour les classes de lycée.
Parmi elles :
http://www.clivia.fr vend du matériel de base et des hormones à prix réduit.
c'est une transfuge de :
Korano, la Balme les Grottes 38390 Montalieu
http://www.pierron.fr vend du nitrate d'argent (rubrique chimie) et de l'acide gibbérélique (rubrique SVT)
(Pierron, 4 rue Gutemberg 57206 Sarreguemines)
Vert'tige Micropolis 05000 Gap (pas d'écho sur cette boîte...)
Et ne chipez pas le matériel dans votre lycée, c'est très mal et c'est comme ça qu'on se fait prendre...
